二氧化锆包覆的二氧化硅核壳型填料制备及选择吸附磷脂

二氧化锆包覆的二氧化硅核壳型填料的制备及在选择性吸附磷脂中的应用研究
摘要
提出了一种基于Zr02/Si02氧化锆 /氧化硅核壳型材料吸附磷脂的分析方法。首先利用NH3/H20内部水解法制备了含不同比例氧化锆 包覆的氧化锆 /Si02核壳型颗粒，并通过电镜和紫外吸收漫反射图谱对其进行了表征，证明在Si02表面包覆有氧化锆 材料。采用RP-HPLC-ELSD（Reversed phase-high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector），以甲醇．水（含醋酸铵）为流动相，优化并建立了5种磷脂的分析方法。在以上基础上将氧化锆 /Si02核壳型材料制成固相萃取(Solid phase extraction，SPE)小柱，以5种磷脂标准品为研究对象，用RPLC-ELSD方法评价了SPE小柱吸附磷脂的效率。发现包覆有3.5%和7%氧化锆 的Zr-02/Si02核壳型材料吸附磷脂的能力均强于单纯的氧化锆材料，且3.5%的Zr02/Si02核壳型材料吸附效果最好，并将其初步应用于血清中磷脂的选择性吸附，结果表明，通过SPE富集后，能检测到更多的磷脂类代谢产物。
关键词磷脂；二氧化锆；核壳；固相萃取；高效液相色谱
1 引 言
磷脂( Phospholipids，PLs)是含有磷酸的脂类，它为两性分子，一端为亲水的含磷酸基团的极性头基，另一端为疏水的含有两条长脂肪酸链的非极性尾部。磷脂是生物体内细胞膜的重要组成部分，在细胞信号传导和细胞凋亡方面发挥着重要作用，它也与许多疾病的发生有关，可作为某些疾病的信号分子。磷脂分为两大类：甘油磷酯类和鞘脂类，甘油磷脂又分为卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇等，所以磷脂的种类繁多。
基于磷脂结构的复杂性和多样性，磷脂分析是一个挑战。常用的有薄层色谱法( TLC)、核磁共振( NMR)、质谱(MS)、气相色谱．质谱联用(GC-MS)和液相色谱．质谱联用(LC-MS)等技术。TLC法灵敏度和分辩率都较低，且易引起磷脂的氧化和分解；CC-MS不适合于直接分析磷脂，因为磷脂没有挥发性，需要经水解、甲酯化等处理；3lp_NMR可利用磷原子3lp来分析各种磷脂，但NMR法的灵敏度较低，仅限于磷脂酰胆碱等组织中含量较高的磷脂样品的测定；MS法，特别是电喷雾质谱(ESI-MS)是目前磷脂分析中应用最多的软电离法，ESI-MS法前处理简单，分析时间短，不足之处在于难以分析丰度较低的磷脂。在此基础上，Han等又开发了基于源内分离的"鸟枪法"和多维质谱法测定磷脂和其他脂质分子。HPLC-ESI-MS具有高分辨率、高灵敏度和特异性强等优点，是磷脂分析的较好工具，但仪器价格昂贵。蒸发光散射检测器（Evaporative light scattering detector，ELSD）作为一种新型通用型检测器，它价格便宜，且无TLC和GC-MS分析磷脂的缺点，在分析过程中不易引起磷脂的氧化和分解，适合直接分析磷脂，在磷脂分析中具有很好的可行性。
在生物样品中磷脂种类繁多，结构复杂，低丰度检测困难，且干扰较多。如果在应用上述方法分析前，先对磷脂进行选择性提取，对于体内的磷脂分析，特别是对发现一些微量的信号分子是很重要的。常用的磷脂提取方法有甲基叔丁基醚( Methyl tert-butyl ether，MTBE)液．液萃取法和固相萃取法(SPE)。SPE比较常用的是氨丙基、氨基或二醇基修饰的硅胶等正相材料，但这些方法选择性普遍不高。
金属氧化物（如氧化锆 等）由于具有路易斯酸一碱的特性，在酸性条件下可以与带有磷酸基团的物质结合，达到与其它物质分离的目的，在碱性条件下洗脱则可达到富集的目的，故金属氧化物选择性富集磷脂是非常有前景的方法，但Zr02本身存在比表面积小，颗粒粒径小，不适合做SPE填料等缺点。本研究采用NH3/H2O内部水解法，将氧化锆负载在球形硅胶微球之上，制成核壳型Zr02/Si02颗粒，并填充为SPE小柱，用于选择性富集磷脂，并采用RPLC-ELSD进行评价。结果表明，本研究获得的核壳型Zr02/Si02颗粒具有良好的富集效率，在生物样品分析中有很好的应用前景。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Shimadzu LC-20AB高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ELSD-UM3000蒸发光散射检测器（上海通微分析技术有限公司）；XW-80A漩涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；飞鸽牌TCL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；BrI224S电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；Molatom1805a摩尔原子型超纯水器（重庆摩尔水处理设备有限公司）；S-4800场发射扫描电子显微镜（日本Hitachi公司），Lambda 950紫外可见近红外分光光度计（美国）；C。反相高效液相色谱柱（250 mm x4.6 mm．5ym，苏州环球色谱有限公司）；
溶血磷脂酰胆碱(1 -Palmitoyl-2 -hydroxy-sn-glycero -phosphocholine，lyso-PC( 16：0))，溶血磷脂酰胆碱(1 -Stearoyl-2 -hydroxy-sn - glycero_3 -phosphocholine，lyso-PC( 18：0))，磷脂酰胆碱（1，2-Dimyristoyl-sn -glyce-ro-3 -phosphocholine，DMPC），磷脂酰乙醇胺(1-Palmitory-2 -oleoyl-sn-glycero-3 -phosphoethanolamine，POPE），磷脂酰胆碱（1-Palmitory-2 -oleoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine，POPC）均购于美国Avanti PolarLipids公司；乙酸铵（国药集团化学试剂有限公司）；20 um球形硅胶（苏州环球色谱公司）；ZrOCl2．8H20（上海阿拉丁试剂有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，上海星可生化有限公司）；异丙醇、正己烷（色谱纯，上海阿拉丁试剂有限公司）；氯仿（分析纯，国药试剂有限公司）；氨水（分析纯，平湖化学试剂厂）。
2.2实验方法
2.2.1 Zr02/sio2填料制备采用NH3/H20内部水解法，制备二氧化锆包覆的二氧化硅核壳结构填料。过程为：采用相当于3. 5%（Zr02/Si02，w/w）的ZrOC12.8H20水溶液多次浸润20 um球形硅胶，并在60℃不断搅拌直至干燥；在100℃下干燥6h，将ZrOCl2负载的Si02放置进14%氨水环境中，在60℃下水浴约4~6 h，然后在500℃马弗炉内煅烧数小时，即得到3. 5%（Zr02/Si02，w/w）包覆的Zr02/Si02核壳型材料。7% Zr02/Si02( w/w)核壳型材料制备方法与上相似。本实验中所用Zr02对照材料由ZrOCl2.8H20直接煅烧得到。
2. 2.2固相萃取步骤将30 mg Zr02/Si02颗粒装填在1 mL SPE小柱内，SPE小柱的顶部和底部分别放入聚丙烯筛板。取150 uL磷脂标准品或者血浆磷脂提取物，溶解在300 uL含1%甲酸的正己烷一异丙醇(2:8，v/v)溶液内，加入到Zr02/Si02填充的SPE小柱中，平衡后回收流出液，记为流出液(No bindingsolution)；用300 uL正己烷一异丙醇(2:8，wv)溶液清洗SPE小柱，回收清洗液，记为清洗液(Washingsolution)；分别用300 uL 7 mol/L氨水一甲醇溶液洗脱，共3次，合并洗脱液，记为洗脱液(Elution)。
而对于Zr02，上样、清洗和洗脱步骤同上述SPE方法相同。只是采用离心的方法，涡旋4 min，静置4 min，10000 r/min离心5 min，取上清液。得到流出液、清洗液和洗脱液后，挥干，分别用150 uL甲醇复溶，备用。
2.3 HPLC-ELSD分析
C8色谱柱(250 mm x4.6 mm，5um)，流动相A:甲醇一水(80:20，V/V）溶液含10 mmol/L乙酸铵，流动相B：甲醇含10 mmol/L乙酸铵。流速：l mUmin，梯度条件：0---15 min，500-/o~100%B；15 ~30 min，100%B。ELSD检测器条件：蒸发温度：45℃，雾化气体：空气，载气流量：2.5Umin，载气压力：322 kPa。
2.4血清样品的制备
健康人血清样品来自瑞金医院志愿者。血清样品中脂质的提取方法为：取血清样品400 uL，加入3 mL甲醇，超声60 s，加入3 mL氯仿，超声60 s，在室温中静置30 min，加入1.5 mL水，使之分层，1500 r/min离心10 min，取下层有机层，在25℃挥干，并用4 mL含1%甲酸的正己烷一异丙醇(2:8v/v)混合溶液复溶，4℃保存至进样。
2.5 UPLC-Q-TOF分析
采用2.2.2节的方法提取的血清中的脂质，经过SPE处理为流出液、清洗液和洗脱液，并分别进UPLC-Q-TOF分析。UPLC C8色谱柱（100 mm×2.Imm，1.7um，美国Thermo Fisher公司）及UPLC18保护柱（5 mm×2.1 mm，ASQUITY UPLC-TM，美国Waters公司），柱温为40℃，流速0.4mL／min，流动相同2.3节，梯度为：0-3 min，1% -50%B，3-7 min，50% -100%B，7-15 min，lOOqoB，正离子模式，进样量为2uL，以氮气作为雾化气，飞行管检测模式V型，毛细管电压（Capillary voltage）3 kV，锥孔电压(Sampling cone) 35 kV，离子源温度(Source temperature) 110℃，脱溶剂气温度(Desolvation temperature)300℃，反向锥空气流(Cone gas flow) 50 L/h，脱溶剂气(Desolvation gas flow) 600 L/h，萃取锥孔( Extraction cone)4 V．离子扫描时间(Scan time)0.03 s，扫描时间间隔(Inter scan time)0.02 s，数据采集范围为m/z 50---1500。
3结果与讨论
3.1 ZrOz/Sio2核壳型填料的制备和表征
在本实验中采用NH3/H2O内部水解法，并用ZrOCl2·8H20替代Zr0( N03)2·2H20，制备了Zr02/Si02核壳型填料。从图可见，Z r02/Si02与Si02形态较为一致，但外表略感粗糙，初步说明在Si02上包覆了Zr02。采用紫外可见漫反射光谱( UV-visible diffuse reflectancespectra)进行固体样品颗粒扫描，包覆有3.5%和7%的Zr02/Si02核壳型填料的吸收光谱与核Si02的吸收光谱有所不同，核壳型填料在300---400 nm相比纯Si02有较强的吸收峰，且包覆比例越高，吸收峰增强越多；另外在2r02可以看到206和230 nm两个吸收峰，其中206 nm是处于四面体结构中的Zr4+_02-之间的电子转移跃迁峰，230 nm是Zr02八面体结构中Zr-O-Zr产生的吸收峰。但对于制备得到核壳型Zr02/Si02材料，只能看到206 nm的Zr4+ _O2-的电子转移跃迁吸收峰，没有230 nm的吸收峰。通过这个数据证明Zr02的确被包覆在Si02表面，且其包覆在Si02表面的Zr02呈高度不饱和的四面体结构。
3.2 RPLC-ELSD磷脂分析
3.2.1 ELSD检测器条件的优化对于ELSD检测器，考察了载气流速对磷脂标准品信噪比(S/N)响，随着载气流速的增加，5种磷脂的信噪比均有一定程度的降低，但考虑到小流速载气易造成磷脂峰的拖尾，导致分离度变差，最终磷脂分析所用的载气流速选择为2.5L/min。另外考察了蒸发温度对5种磷脂的信噪比( S/N)的影响，50℃时各磷脂的信噪比最高，但是有文献报道磷脂在45℃以上有受热分解的可能，且50℃时基线噪声比较大。因此，蒸发温度选择为45℃。
3.2.2磷脂在RPLC-ELSD体系的分离磷脂非极性较强，很多文献中采用正相色谱模式分离磷脂类化合物。但正相色谱流动相毒性大，色谱系统不稳定，且不易与质谱联用。本实验拟采用反相色谱模式，但由于磷脂在通常的C18色谱柱上保留过强，不易洗脱，故本实验选用非极性较弱的C8柱作为分离所用的色谱柱。
考察了乙腈和甲醇等溶剂洗脱效果，发现甲醇对于磷脂的洗脱更加有利，且在流动相中加入一定浓度的乙酸铵或者甲酸铵，有利于改善磷脂峰的拖尾现象，故最终选定的流动相体系为甲醇．水（含10 mmol/L乙酸铵）。本实验选用的5种磷脂，都为体内特征的磷脂，既有较亲水的溶血磷脂，如溶血磷脂酰胆碱lyso-PC( 16：0)，溶血磷脂酰胆碱lyso-PC( 18：0)，也有疏水性较强的磷脂，如酰乙醇胺( POPE)，磷脂酰胆碱(POPC)和磷脂酰胆碱(DMPC)。本方法可以将5种极性相差较大的磷脂同时分开，且分离度很好。
3.2.3 RPLC-ELSD测定方法的验证分别测定了5种磷脂在最优化RPLC-ELSD分析方法下的线性范围、相关系数、检出限和定量限，线性良好，方法的检出限在0.5---1.0 mg/L范围内，定量限为1.0-3.5mg/L范围内。
3.3核壳型材料Zr02/Si02吸附磷脂的研究
3. 3.1核壳型材料Zr02/Si02吸附磷脂的性能为了表征Zr02/Si02填料的富集磷脂的能力，选择了5种体内特征磷脂，采用制备的Zr02/Si0，SPE小柱对这5种磷脂进行吸附和洗脱。对比可见，在流出液和清洗液中均没有磷脂出峰，说明磷脂已经完全吸附在Zr02/Si02SPE小柱上，经过氨水．甲醇溶液洗脱后，在洗脱液的色谱图中出现了5种磷脂的色谱峰，说明吸附在Zr02/Si02 100SPE小柱上的磷脂又都被洗脱下来，得以回收，证明本研究制备的Zr02/Si02具有吸附磷脂的特性。
3.3.2 ZrO2/SiO2吸附磷脂回收率评价 进一步考察了Zr02/Si02核壳性填料对磷脂吸附效率，测定了纯Zr02、3.5% Zr02/Si02和70-/0 Zr02/Si02吸附磷脂后的回收率，结果如图6所示。与纯Zr02相比较，包覆有3. 5%和7% Zr02的Zr02/Si02核壳型材料对5种磷脂的回收率均优于纯Zr02材料，这可能与Zr02比表面较小有关。除了DMPC，其它4种磷脂在3.5% Zr02/Si02和7% Zr02/Si02上的回收率均高于70%，且3.5%Zr02/Si02材料的回收率好于7% Zr02/Si02，这可能与负载量增大导致核壳颗粒比表面积下降有关。
实验表明，合成的Zr02/Si02核壳性填料对磷脂的吸附能力优于纯Zr02材料。预测在生物样品的磷脂测定中，此材料一方面能排除体内其他内源性物质的干扰，并且可通过富集分离提高磷脂的测定浓度和测定种类。
3.4血清中内源性磷脂UPLC-Q-TOF分析
血清中磷脂代谢与许多疾病的发生都有关系，富集和检测到更多低丰度的磷脂对于生物标志物的发现是很有意义的。由于合成Zr02/Si02具有较大的比表面积和对磷脂的特异性吸附特性，采用Zr02/Si02 SPE小柱预处理健康人血清样品后，用UPLC-Q-TOF测定，通过数据分析和数据库检索，可比直接进样多检测到49个代谢产物，如磷脂酰乙醇胺PE( 14：0/20：0)、缩醛磷脂酰乙醇胺pPE( 18：0/20：3)磷脂酰肌醇PI (16：0/20：0)等（具体数据另文发表），这为下一步深入研究Zr02/Si02在代谢组学、脂质组学的应用打下了良好的基础。